微(wei)量(liang)凱(kai)氏(shi)定氮(dan)法介(jie)紹

  蛋白質(zhi)的(de)定量測定方法：微(wei)量(liang)凱(kai)氏(shi)定氮(dan)法
　　【實驗目的】
　　學(xue)習凱氏(shi)定氮(dan)法的原理(li)和(he)操作(zuo)技(ji)術。
　　微(wei)量(liang)凱(kai)氏(shi)定氮(dan)法【實驗原理】
　　凱(kai)氏定氮(dan)法用於測定有機(ji)物(wu)的含(han)氮(dan)量,若蛋白質(zhi)的(de)含(han)氮(dan)量已知(zhi)時(shi)，則可用(yong)此(ci)法測定樣品中(zhong)蛋白質(zhi)的(de)含(han)量(liang)。
　　當蛋白質(zhi)與(yu)濃(nong)硫酸(suan)共(gong)熱(re)時，其(qi)中(zhong)的碳(tan)、氫(qing)兩(liang)元(yuan)素(su)被(bei)氧化成二氧化碳(tan)和(he)水(shui)，而氮則轉(zhuan)變(bian)成(cheng)氨(an)，並(bing)進壹步與(yu)硫酸(suan)作(zuo)用(yong)生(sheng)成硫酸(suan)銨(an)。此(ci)過程通常稱為(wei)“消(xiao)化"。但是，這個反(fan)應(ying)進行(xing)得比較(jiao)緩慢，通常需要加(jia)入硫酸(suan)鉀(jia)或(huo)硫(liu)酸(suan)鈉(na)以(yi)提高反(fan)應(ying)液(ye)的(de)沸點(dian)，並(bing)加(jia)入硫酸(suan)銅(tong)作為(wei)催(cui)化劑(ji)，以(yi)促進反(fan)應(ying)的(de)進行(xing)。
　　消化完成(cheng)後，在凱(kai)氏(shi)定氮(dan)儀(yi)中(zhong)加(jia)入濃(nong)堿，可使消化液中(zhong)的硫(liu)酸(suan)銨(an)分解(jie)，遊(you)離出氨(an)，借(jie)助水(shui)蒸(zheng)汽(qi)蒸(zheng)餾法，將產(chan)生(sheng)的氨(an)蒸(zheng)餾到量、濃(nong)度的硼酸(suan)溶(rong)液(ye)中(zhong)，硼酸(suan)吸(xi)收氨(an)後(hou)，氨與(yu)溶(rong)液(ye)中(zhong)氫離(li)子(zi)結合(he)，使溶(rong)液(ye)中(zhong)的氫(qing)離子(zi)濃(nong)度降低(di)，指(zhi)示劑(ji)顏色改變(bian)，然後用標準無(wu)機(ji)鹽酸(suan)滴(di)定(ding)，直(zhi)至(zhi)恢(hui)復(fu)溶(rong)液(ye)中(zhong)原來(lai)的氫離子(zi)濃(nong)度為(wei)止(zhi)。根(gen)據所用(yong)標準(zhun)鹽(yan)酸(suan)的(de)量(liang)可計(ji)算出待測物(wu)中(zhong)的總(zong)氮量。
　　蛋白質(zhi)的(de)含(han)氮(dan)量為(wei)16%，即1克(ke)蛋白質(zhi)中(zhong)的氮(dan)相當於6.25克蛋白質(zhi)，用(yong)凱氏定(ding)氮法測出的(de)含(han)氮(dan)量乘以(yi)6.25,即得樣品中(zhong)蛋白質(zhi)的(de)含(han)量(liang)。
　　微(wei)量(liang)凱(kai)氏(shi)定氮(dan)法【實驗材(cai)料】
　　1.實驗器(qi)材(cai)
　　微(wei)量(liang)凱(kai)氏(shi)定氮(dan)儀(yi)1套；50ml凱氏燒瓶4個(ge)；移液管；錐形瓶；試(shi)管；小玻璃珠(zhu)
　　2.試(shi)驗(yan)試(shi)劑(ji)
　　(1)濃(nong)硫酸(suan)；30％氫(qing)氧化鈉(na)溶(rong)液(ye)；2％硼酸(suan)溶(rong)液(ye)；標(biao)準鹽(yan)酸(suan)溶(rong)液(ye)(0.01mol／L)。
　　(2)粉(fen)末硫(liu)酸(suan)鉀(jia)—硫(liu)酸(suan)銅(tong)混合(he)物(wu)：K2SO4與(yu)CuSO4·5H2O以(yi)3：1配比(bi)研磨混合。
　　(3)混合指(zhi)示劑(ji)(田(tian)氏(shi)指(zhi)示劑(ji))：由(you)50ml0.1％甲(jia)烯藍乙醇(chun)溶(rong)液(ye)與(yu)200ml0.1％甲基紅乙醇(chun)溶(rong)液(ye)混(hun)合配(pei)成(cheng)，貯於(yu)棕(zong)色瓶中(zhong)備用(yong)。
　　(4)樣品溶(rong)液(ye)：配(pei)制3mg/ml的(de)牛血(xue)清白(bai)蛋白溶(rong)液(ye)作(zuo)為(wei)樣品。
　　【實驗操作(zuo)】
　　1.安(an)裝(zhuang)凱(kai)氏定(ding)氮(dan)儀(yi)。
　　2.消(xiao)化：取4個50ml凱(kai)氏(shi)燒瓶並(bing)標(biao)號,各(ge)加(jia)1顆(ke)玻(bo)璃珠(zhu)，在1號(hao)及(ji)2號瓶中(zhong)各加(jia)樣品1ml，催(cui)化劑(ji)(K2SO4-CuSO4·5H2O)200mg，濃(nong)硫酸(suan)5ml。註(zhu)意加(jia)樣品時(shi)應(ying)直(zhi)接(jie)送入瓶底(di)，而不要沾(zhan)在瓶口(kou)和(he)瓶頸(jing)上。在3號(hao)及(ji)4號瓶中(zhong)各加(jia)1ml蒸(zheng)餾水(shui)和與(yu)1、2號瓶相(xiang)同(tong)量的(de)催(cui)化劑(ji)和濃(nong)硫酸(suan)，作(zuo)為(wei)對(dui)照。在通風櫥(chu)內進行(xing)消化。
　　在消(xiao)化開始時(shi)應(ying)控制(zhi)火力，不要使液體沖到瓶頸(jing)。待硫酸(suan)開始分解(jie)並(bing)放出SO2白(bai)煙後(hou)，適(shi)當加(jia)強(qiang)火力，繼續消(xiao)化，直(zhi)至(zhi)消(xiao)化液呈(cheng)透明(ming)淡(dan)綠(lv)色為(wei)止(zhi)。撤(che)掉(diao)火力，冷(leng)卻(que)至(zhi)室(shi)溫(wen)。