如(ru)何用(yong)濾(lv)膜(mo)法測(ce)細菌總數-集(ji)菌儀(yi)

 如(ru)何用(yong)濾(lv)膜(mo)法測(ce)細菌總數-集(ji)菌儀(yi)

基(ji)於(yu)濾膜上(shang)細菌直(zhi)接計數(shu)法的(de)細菌總數快(kuai)速檢(jian)測(ce)
【摘(zhai)要】 細菌總數快(kuai)速檢(jian)測(ce)在(zai)質量(liang)監測(ce)中(zhong)具有(you)重要(yao)的意(yi)義，目前(qian)除了(le)經典(dian)的平板(ban)培養法以(yi)外，還有(you)微菌落法、阻(zu)抗法(fa)等快速檢(jian)測(ce)方(fang)法(fa)，這(zhe)些方(fang)法(fa)或(huo)者(zhe)需要(yao)較(jiao)長(chang)的(de)檢(jian)測(ce)時間，或者(zhe)需要(yao)較(jiao)高的(de)檢(jian)測(ce)成本。本研究提(ti)出(chu)壹(yi)種(zhong)不需要培(pei)養而在(zai)濾膜(mo)上(shang)直(zhi)接計數(shu)的細菌總數的(de)快速檢(jian)測(ce)方(fang)法(fa)，它主要分為過濾、染色、顯(xian)微(wei)鏡(jing)計(ji)數和(he)計算(suan)四(si)個步驟。計算(suan)細菌總數時，根(gen)據(ju)細菌在(zai)濾膜(mo)上(shang)的分布特點(dian)，對傳統(tong)公(gong)式進(jin)行改(gai)進，提(ti)出(chu)按(an)區域計(ji)算(suan)細菌總數的(de)計算(suan)方(fang)法(fa)，提(ti)高了(le)檢(jian)測(ce)精度(du)。研究結(jie)果(guo)表明(ming)，該(gai)方(fang)法(fa)與(yu)傳統(tong)的平(ping)板培(pei)養法無(wu)顯(xian)著(zhu)性(xing)差異(yi)（t=0.847，P=0.436＞0.05），是(shi)壹(yi)種(zhong)低(di)成本、快速的(de)細菌總數檢(jian)測(ce)方(fang)法(fa)。
1 引(yin) 言
細菌總數計(ji)數的研究已(yi)有(you)很多(duo)，目前(qian)國標(biao)規(gui)定(ding)的方(fang)法(fa)為(wei)平(ping)板計數法，該(gai)方(fang)法(fa)是(shi)將樣(yang)品加入(ru)瓊(qiong)脂營(ying)養基(ji)，在(zai)37 ℃下培(pei)養24～48 h後計(ji)數。這(zhe)種(zhong)方(fang)法(fa)精(jing)度(du)高，但(dan)耗時長，難以(yi)滿足(zu)實際(ji)工作需要。為(wei)了(le)簡(jian)化(hua)檢(jian)測(ce)程序(xu)、縮短檢(jian)測(ce)時間，國內外學者(zhe)進行了大量的(de)快速(su)檢(jian)測(ce)方(fang)法(fa)的(de)研究，提(ti)出(chu)了(le)阻(zu)抗檢(jian)測(ce)法〔1〕、Simplate TM全(quan)平(ping)器(qi)計數法(fa)〔2〕、微(wei)菌落技(ji)術〔3-5〕、紙片法〔6-7〕等檢(jian)測(ce)方(fang)法(fa)，取(qu)得了(le)的成果，但(dan)檢(jian)測(ce)時間仍在(zai)4 h以上(shang)。
本研究在(zai)分析了已(yi)有(you)研究成(cheng)果(guo)的基(ji)礎(chu)上(shang)，提(ti)出(chu)了(le)在(zai)濾膜(mo)上(shang)染色後(hou)，直(zhi)接計數(shu)的細菌總數檢(jian)測(ce)方(fang)法(fa)，具(ju)體(ti)步驟為：用(yong)集(ji)菌儀(yi)進(jin)行細菌收(shou)集(ji)→在(zai)膜上(shang)進行染色→在(zai)油鏡(jing)下(xia)計數→按公(gong)式計(ji)算(suan)出(chu)菌液(ye)濃(nong)度(du)。實驗(yan)結果表明(ming)，該(gai)方(fang)法(fa)與(yu)傳統(tong)的平(ping)板培(pei)養法無(wu)顯(xian)著(zhu)性(xing)差異(yi)，檢(jian)測(ce)時間約(yue)1 h，是(shi)壹(yi)種(zhong)快速的細菌總數檢(jian)測(ce)方(fang)法(fa)。
2 材(cai)料與(yu)方(fang)法(fa)
2.1 材(cai)料
本研究中(zhong)用(yong)的(de)試驗(yan)材料有(you)集菌儀(yi)（杭(hang)州(zhou)泰(tai)林(lin)生(sheng)物(wu)技(ji)術設(she)備(bei)有(you)限公(gong)司），染色劑(ji)，生(sheng)物(wu)顯(xian)微(wei)鏡(jing)（寧波(bo)永新(xin)光(guang)學股份(fen)有(you)限公(gong)司），聚碳酸(suan)脂(zhi)膜(mo)（直(zhi)徑(jing)47 mm）。
2.2 實驗(yan)方(fang)法(fa)
2.2.1 準(zhun)備(bei)工作(zuo) 卸下(xia)集菌儀(yi)的(de)濾(lv)網（見圖(tu)1），統計濾網上(shang)小孔總數，為(wei)計算(suan)菌液(ye)濃(nong)度(du)做(zuo)準(zhun)備(bei)。另外，還需(xu)對(dui)集(ji)菌儀(yi)中(zhong)的集菌器(qi)進行高壓(ya)滅(mie)菌，以(yi)防(fang)止(zhi)過濾過程中(zhong)引(yin)入(ru)外源細菌。
2.2.2 細菌收(shou)集(ji) 取(qu)濃度的(de)黴菌菌液(ye)300～500 ml，裝在(zai)集菌儀(yi)上(shang)，集菌儀(yi)采用(yong)蠕(ru)動加(jia)壓(ya)方(fang)式(shi)對(dui)菌液(ye)施(shi)加的(de)壓(ya)力，使菌液(ye)流(liu)過孔徑(jing)為0.45 um的聚碳酸(suan)脂(zhi)膜(mo)。采用(yong)過濾方(fang)法(fa)是(shi)因(yin)為(wei)它可以(yi)使細菌相(xiang)對(dui)均(jun)勻地分布在(zai)濾膜(mo)上(shang)，而選用(yong)聚碳酸(suan)脂(zhi)膜(mo)是(shi)因(yin)為(wei)這(zhe)種(zhong)膜具有(you)良好(hao)的透(tou)光(guang)性，便(bian)於用(yong)顯(xian)微(wei)鏡(jing)觀(guan)察。
2.2.3 染(ran)色 集(ji)菌後(hou)取(qu)下濾膜(mo)，切下壹(yi)部分放在(zai)載玻(bo)片(pian)上(shang)，進行染色、固(gu)定(ding)。染(ran)色的(de)目的是(shi)增大細菌與(yu)背景(jing)的對比(bi)度，便於(yu)觀(guan)察。
2.2.4 顯(xian)微(wei)鏡(jing)計(ji)數與(yu)計算(suan) 菌液(ye)經集菌儀(yi)過濾後，細菌在(zai)濾膜(mo)上(shang)的分布見圖(tu)2、圖3，由圖可以看(kan)出(chu)細菌分布具有(you)以下(xia)兩個(ge)特點(dian)：壹是細菌集(ji)中(zhong)在(zai)壹個(ge)個(ge)的(de)圓形區域內，這(zhe)些圓(yuan)形區域和(he)擋板(ban)的(de)小孔(kong)相對應；二是(shi)各個(ge)圓(yuan)形區域之(zhi)間細菌很(hen)少。根(gen)據(ju)膜(mo)上(shang)細菌分布的這(zhe)種(zhong)特點(dian)，提(ti)出(chu)以(yi)圓形區域為(wei)單(dan)位(wei)進(jin)行計數(shu)，統(tong)計出(chu)圓(yuan)形區域內細菌的(de)平(ping)均(jun)個(ge)數，從而計(ji)算(suan)出(chu)菌液(ye)中(zhong)細菌總數。具(ju)體步驟如(ru)下：隨(sui)機選擇10個(ge)圓(yuan)形區域，在(zai)油鏡(jing)下(xia)，調節焦距以(yi)獲得較(jiao)清晰(xi)的(de)圖(tu)像（見圖(tu)4），統計每(mei)個圓(yuan)形區域內的細菌個(ge)數(shu)，然(ran)後(hou)按公(gong)式(1)計(ji)算(suan)出(chu)菌液(ye)的(de)濃(nong)度(du)。
X=A10×N/V(1)圖2 膜上(shang)細菌的(de)區域分布
Fig 2 The distributing region of bacteria on the filter(100倍(bei))
圖3 膜(mo)上(shang)細菌的(de)區域間隔
Fig 3 The space among the distributing regions(100倍(bei))
圖4 膜(mo)上(shang)細菌染(ran)色後(hou)圖(tu)像(xiang)
Fig 4 Figure of bacteria after coloration(1 000倍(bei))
式中(zhong)：X表示(shi)待(dai)檢(jian)菌液(ye)濃(nong)度(du)（CFU/ml）
A表示(shi)10個(ge)圓形區域內細菌總數
N表示(shi)濾(lv)網上(shang)小孔總數
V表示(shi)集(ji)菌時所用(yong)待(dai)檢(jian)菌液(ye)體(ti)積（ml）
3 結(jie)果(guo)與(yu)討論(lun)
3.1 實驗(yan)結果
按上(shang)述方(fang)法(fa)計(ji)算(suan)得到(dao)的(de)結果與(yu)平板(ban)培(pei)養法得到(dao)的(de)結果見表1。表1 兩(liang)種(zhong)方(fang)法(fa)得到(dao)的(de)細菌總數
Table 1 Total bacteria number by two different methods
樣(yang)本1樣(yang)本2樣(yang)本3樣(yang)本4樣(yang)本5樣(yang)本6染色鏡(jing)檢(jian)
(cfu/ml）185168157165171166平板(ban)培養
(cfu/ml)176155165158183152
對表1中(zhong)兩組數據(ju)進(jin)行配(pei)對t檢(jian)驗(yan)，在(zai)α=0.05時，雙(shuang)尾(wei)檢(jian)驗(yan)結果如(ru)下：t=0.847，P=0.436＞0.05，說(shuo)明(ming)兩(liang)種(zhong)方(fang)法(fa)得到(dao)的(de)結果無(wu)顯(xian)著(zhu)性(xing)差異(yi)。
3.2 討(tao)論(lun)
3.2.1 計(ji)算(suan)公(gong)式的(de)改(gai)進 用(yong)集(ji)菌儀(yi)對(dui)樣(yang)本菌液(ye)進(jin)行過濾時，由於濾(lv)網擋板(ban)的(de)作用(yong)，使得細菌不(bu)是(shi)均(jun)勻地分布在(zai)整(zheng)個濾(lv)膜(mo)上(shang)，而是集(ji)中(zhong)分布在(zai)濾網的(de)小孔(kong)處(chu)，所以，計(ji)算(suan)細菌總數時，不能采用(yong)公(gong)式X=A40×Φ1Φ22/V（其(qi)中(zhong)Φ1，Φ2分別為濾(lv)膜直(zhi)徑(jing)和(he)視野直(zhi)徑(jing)），該公(gong)式是(shi)微(wei)菌落方(fang)法(fa)檢(jian)測(ce)細菌總數中(zhong)的常用(yong)計(ji)算(suan)公(gong)式。在(zai)本實驗(yan)中(zhong)，根(gen)據(ju)細菌分布的特點(dian)，提(ti)出(chu)以(yi)圓形區域為(wei)單(dan)位(wei)計(ji)算(suan)細菌總數的(de)思路，使計算(suan)結果更接近真實值，從而提(ti)高了(le)檢(jian)測(ce)精度(du)。
3.2.2 細菌大小的(de)影(ying)響 細菌大小對(dui)本實驗(yan)的影(ying)響主要體(ti)現在(zai)鏡(jing)檢(jian)時，如(ru)果細菌太(tai)小(xiao)，顯(xian)微(wei)鏡(jing)計(ji)數時不能將細菌從(cong)背景(jing)中(zhong)分辨(bian)出(chu)來，我們(men)的(de)實驗(yan)結果顯(xian)示(shi)，不能分辨(bian)大腸(chang)桿菌和(he)葡(pu)萄(tao)球(qiu)菌，而(er)較(jiao)大的黴(mei)菌可(ke)以(yi)清(qing)晰(xi)地(di)分辨(bian)。
3.2.3 檢(jian)測(ce)時間進壹(yi)步縮短 細菌總數的(de)經典(dian)檢(jian)測(ce)方(fang)法(fa)是(shi)平(ping)板培養法，得到(dao)的(de)結果精度(du)高，但(dan)是它所用(yong)時間長，為(wei)了縮短檢(jian)測(ce)時間，出(chu)現了微(wei)菌落法，將檢(jian)測(ce)時間縮短為(wei)4 h左右〔3-5〕。本研究不(bu)對(dui)細菌進(jin)行培養，而是(shi)在(zai)膜上(shang)染色後(hou)直(zhi)接用(yong)顯(xian)微(wei)鏡(jing)計(ji)數，大限度(du)地縮短了(le)檢(jian)測(ce)時間，使整(zheng)個檢(jian)測(ce)時間在(zai)1 h左右。
4 結論(lun)
本研究用(yong)集(ji)菌儀(yi)將菌液(ye)過濾後，取(qu)濾膜壹(yi)部分進行染色、制片(pian)，然後在(zai)油鏡(jing)下(xia)統計細菌個(ge)數(shu)。根(gen)據(ju)細菌在(zai)濾膜(mo)上(shang)的分布特點(dian)，提(ti)出(chu)將圓(yuan)形區域作(zuo)為統計(ji)單(dan)位(wei)，得到(dao)圓(yuan)形區域內細菌的(de)平(ping)均(jun)個(ge)數，從而計(ji)算(suan)出(chu)菌液(ye)濃(nong)度(du)。實驗(yan)結果表明(ming)，按(an)照該(gai)方(fang)法(fa)得到(dao)的(de)結果與(yu)平板(ban)培(pei)養法的(de)結果(guo)無(wu)顯(xian)著(zhu)性(xing)差異(yi)。與(yu)平板(ban)培(pei)養法和(he)微菌落法相比，該(gai)方(fang)法(fa)不(bu)需(xu)要細菌培(pei)養，檢(jian)測(ce)時間只需(xu)要1 h左右，明(ming)顯(xian)縮短了(le)檢(jian)測(ce)時間，是壹(yi)種(zhong)快速、有(you)效(xiao)的(de)細菌總數檢(jian)測(ce)方(fang)法(fa)。