細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)器(qi)的(de)原(yuan)理

細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)器(qi)的(de)原(yuan)理

     細(xi)胞(bao)培(pei)養技(ji)術中，細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)是(shi)壹(yi)項基本(ben)功(gong)，對(dui)於標(biao)準(zhun)化(hua)培(pei)養條(tiao)件以及需要(yao)定量的實(shi)驗(yan)來(lai)說(shuo)都關(guan)鍵。這裏介紹(shao)使用(yong)血(xue)細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)器(qi)對(dui)細(xi)胞(bao)進(jin)行計數(shu)的(de)經典(dian)方(fang)法(fa)以及中間(jian)壹(yi)些需要(yao)註意的(de)細(xi)節(jie)。
制(zhi)備細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)：
對(dui)於貼(tie)壁生(sheng)長(chang)的(de)細(xi)胞(bao)，我們需要(yao)使用(yong)胰(yi)酶消(xiao)化的方法(fa)使細(xi)胞(bao)從(cong)培(pei)養皿(min)表面脫(tuo)落
根據需要(yao)加入(ru)合(he)適體(ti)積(ji)的培(pei)養基，將細(xi)胞(bao)進(jin)行中和及稀(xi)釋(shi)，以得到(dao)均質(zhi)的細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)。要求(qiu)盡(jin)可能將細(xi)胞(bao)吹(chui)打(da)散開，不(bu)要(yao)殘留(liu)任何細(xi)胞(bao)團
準(zhun)備(bei)血(xue)細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)器(qi)：
使用(yong)70%乙(yi)醇(chun)將蓋(gai)玻(bo)片和(he)血細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)器(qi)清潔幹(gan)凈(jing)
將將蓋(gai)玻(bo)片潤濕(shi)（使用(yong)水(shui)或(huo)呼(hu)壹(yi)口氣(qi)，目的(de)是使蓋玻片與(yu)血細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)器(qi)接(jie)觸(chu)更緊密(mi)，易於(yu)粘(zhan)連(lian)），並(bing)覆蓋至血細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)器(qi)上
臺盼(pan)蘭(lan)染色（可選）：
如果(guo)需要(yao)計算細(xi)胞(bao)的(de)活力(li)，則(ze)需要(yao)將細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)和0.4%臺盼(pan)蘭(lan)等(deng)體積(ji)混合(he)
室溫(wen)孵育(yu)3-5分(fen)鐘(zhong)，使臺盼(pan)蘭(lan)進(jin)入(ru)死細(xi)胞(bao)，使死細(xi)胞(bao)著(zhe)藍(lan)色(se)
血細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)器(qi)加樣：
使用(yong)吸管(guan)將細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)或(huo)細(xi)胞(bao)/臺盼(pan)蘭(lan)混合(he)液(ye)滴加到(dao)血細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)器(qi)計(ji)數(shu)池(chi)的(de)邊(bian)緣(yuan)。此(ci)時(shi)液(ye)滴將在虹(hong)吸的(de)作(zuo)用(yong)下進(jin)入(ru)蓋玻(bo)片下方的(de)計數(shu)池(chi)
以同樣(yang)的方式(shi)在另壹(yi)側的(de)計(ji)數(shu)池(chi)中也加入(ru)細(xi)胞(bao)懸(xuan)液(ye)
將計(ji)數(shu)板放(fang)置(zhi)幾分(fen)鐘(zhong)使細(xi)胞(bao)擴(kuo)散，同時(shi)用(yong)吸水(shui)紙(zhi)吸除(chu)多余的(de)液(ye)體
細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)：
在100倍顯微(wei)鏡(jing)下，移動(dong)計(ji)數(shu)板將視(shi)野(ye)對(dui)準(zhun)計(ji)數(shu)板的中央大方塊(kuai)，該(gai)方塊(kuai)四(si)周有壹(yi)圈3條(tiao)平行線包(bao)圍(wei)，中間(jian)有密集的(de)網(wang)格。中央方塊區(qu)差(cha)不(bu)多(duo)剛好可以填(tian)滿(man)整(zheng)個(ge)視(shi)野(ye)
使用(yong)手(shou)持式(shi)計數(shu)器(qi)記錄(lu)計數(shu)池(chi)四(si)個(ge)角以及中央方塊內(nei)的細(xi)胞(bao)數(shu)（1-5號位(wei)置，經典(dian)的(de)current-protocol推(tui)薦(jian)每(mei)個(ge)方(fang)塊細(xi)胞(bao)數(shu)應(ying)不(bu)大(da)於20-50），並(bing)重(zhong)復(fu)記錄(lu)另壹(yi)側計(ji)數(shu)池(chi)中的細(xi)胞(bao)數(shu)，總(zong)計(ji)十(shi)個(ge)方塊。計數(shu)的(de)方(fang)法(fa)是(shi)只計(ji)算上邊(bian)和(he)左(zuo)邊(bian)壓線(xian)的(de)細(xi)胞(bao)，而右(you)邊(bian)和(he)下邊(bian)壓線(xian)的(de)細(xi)胞(bao)不(bu)予(yu)計(ji)算（下圖，總(zong)體(ti)原(yuan)則(ze)是(shi)“計(ji)上不(bu)計(ji)下，計左(zuo)不(bu)計(ji)右"，判斷(duan)標(biao)準(zhun)為(wei)是(shi)否接觸(chu)三條(tiao)邊(bian)線(xian)的(de)中間(jian)線(xian)）。如果(guo)有多個細(xi)胞(bao)沒(mei)有吹散成(cheng)團存(cun)在，此時(shi)只可記為壹(yi)個細(xi)胞(bao)。如果(guo)團塊(kuai)很(hen)多(duo)，則(ze)可能需要(yao)重(zhong)新吹(chui)打甚至消(xiao)化直至絕大(da)多數(shu)細(xi)胞(bao)為(wei)單個細(xi)胞(bao)